신․구조문 대비표

현 행	개 정(안)
제7. 일반시험법 23. 유전자재조합식품의 시험법 1)～2) (생 략) 3) DNA 추출․정제법 (1) CTAB법 ---- 55℃에서 30분간 정치한다. 혼합기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500㎕를 가하여 잘 혼합한 후 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 500㎕를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합한 후, 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 7,500×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500㎕의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 7,500×g로 1분간 실온에서 원심분리하고, ------ 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250㎕를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 7,500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴다. ---- 200㎕의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회정도 뒤집어 준 후, 7,500×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. ----- 그런 다음 7,500×g로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물을 건조시킨다. -------	제7. 일반시험법 23. 유전자재조합식품의 시험법 1)～2) (현행과 같음) 3) DNA 추출․정제법 (1) CTAB법 ---- 55℃에서 30분간 정치한다. 이때 매 10분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 한다. 30분간 반응 이후 혼합기로 충분히 혼합하여 균질화한 용액 600㎕를 1.5㎖ 튜브에 넣고 페놀-클로로포름 혼합액 500㎕를 가하여 잘 혼합한 후 12,000×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 중간층에 닿지 않도록 조심해서 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴 후 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 500㎕를 가하여 혼합기를 이용하여 잘 혼합한 후, 12,000×g로 15분간 실온에서 원심 분리한다. 다시 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮기고 동량의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액을 버리고, 침전물에 500㎕의 70% 에탄올을 벽면으로 천천히 가한 후 12,000×g로 1분간 실온에서 원심분리하고, ------ 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액 250㎕를 가하여 혼합기로 가볍게 혼합하여, 실온에서 12,000×g로 15분간 실온에서 원심 분리한 후, 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮긴다. ----- 200㎕의 이소프로필알콜을 가하여 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후, 12,000×g로 10분간 실온에서 원심 분리한다. ------ 그런 다음 12,000×g로 1분간 실온에서 원심분리하여 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거하고 침전물을 건조시킨다. -------

현 행	개 정(안)
(2) 실리카겔 막 형태를 이용한 방법 ① 콩 또는 콩 가공품 QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, 미리 65℃로 가온한 AP1완충액 10㎖와 -------- 1시간 반응 이후 3,000×g로 10분간 실온에서 원심 분리하고 ------- AP2 완충액 2.5㎖를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(8㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 -------- 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ------ 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 ------ ② 옥수수 또는 옥수수 가공품 QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, 미리 65℃로 가온한 AP1완충액 5㎖와 ------- AP2 완충액 1.8㎖를 가하여 얼음 속에 15분간 정치한 후, 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다. 맑은 상층액(4.2㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 ------ 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ---- 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 -----	(2) 실리카겔 막 형태를 이용한 방법 ① 콩 또는 콩 가공품 QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, AP1완충액(미리 65℃로 가온한 것) 10㎖와 -------- 1시간 반응 이후 스윙로터(Swinging-bucket Rotor)를 사용하여 3,000×g로 10분간 실온에서 원심 분리하고 ------ AP2 완충액 2.5㎖를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(8㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후 -------- 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터(Fixed-angle Rotor)를 사용하여 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 ------ 이 때 침전물이 완전히 건조되지 않도록 주의한다. 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 ----- ② 옥수수 또는 옥수수 가공품 QIAGEN Plan Maxi kit를 이용할 경우 균질하게 분쇄된 시료 1g을 폴리프로필렌 튜브(50㎖용)에 넣고, AP1완충액(미리 65℃로 가온한 것) 5㎖와 ------- AP2 완충액 1.8㎖를 가하여 혼합 후 얼음 속에 15분간 정치한 후, 스윙로터를 사용하여 3,000×g로 35분간 실온에서 원심 분리한다(상층액이 깨끗하지 않은 경우 원심분리를 반복하여 실시한다). 상층에 생기는 막과 침전물을 건드리지 않게 조심하면서 맑은 상층액(4.2㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮긴 후------동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치한다. 고정식 로터(Fixed-angle

현 행	개 정(안)
③ (생 략) 4) DNA 시료의 농도 및 순도 확인과 농축 ------ 추출 DNA시료 원액의 농축은 3M 초산나트륨 (pH5.2) ----- 5) 정성분석방법 ----- 증폭된 DNA를 확인한다. PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 자체적으로 제작한 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있다. PCR에서는 주형 DNA가 ---- (1) 프라이머의 준비 ① 자체적으로 제작한 프라이머를 사용하는 방법 유전자재조합 콩, 옥수수, 감자 검출용 프라이머는 다음 표 1과 같은 AOAC학회지에 보고된 방법에 따라 합성하여 이용할 수 있으며, 이들은 현재 Nippon Gene사(일본)에서도 제작하여 시판하고 있다(표 2). 그 밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머를 설계하여 사용할 수 있다. ② 시판 GMO 검출 키트롤 사용하는 방법 시판되고 있는 유전자재조합 콩, 옥수수, 감자 검출 키트를 사용할 수 있으나, 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법과 동등한 결과를 얻을 수 있어야 한다. 또한, PCR 산물이 200bp 이상 생성되는 프라이머를 설계하는 것은 가공식품 분석에는 적합하지 않다.	Rotor)를 사용하여 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후------이 때 침전물이 완전히 건조되지 않도록 주의한다. 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH8.0)을 가하고 ----- ③ (현행과 같음) 4) DNA 시료의 농도 및 순도 확인과 농축 ------ 추출 DNA시료 원액의 농축은 시중에 판매되고 있는 DNA 농축킷트를 사용하거나, 다음과 같은 방법에 의한다. 3M 초산나트륨 (pH5.2) -------- 5) 정성분석방법 ----- 증폭된 DNA를 확인한다. PCR에서는 주형 DNA가 ---- (1) 프라이머의 준비 PCR에 의한 유전자재조합식품의 검출에 사용되는 프라이머는 표 1 및 표 2와 같다. 그밖에 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머 또는 GMO 검출키트를 이용할 수 있으나, PCR 증폭산물이 200bp 이상이 되게 하는 프라이머는 가공식품 분석용으로 적합하지 않다.

현  행

개 정(안)

표 1. AOAC학회지에 보고된 방법에 사용된 프라이머 및 프로브

목적	품종	프라이머/ 프로브	염기서열
구조 유전자	[옥수수] <신설>	<신설>	<신설>

표 1. PCR 검사에 사용되는 프라이머 및 프로브

목적	품종	프라이머/ 프로브	염기서열
구조 유전자	[옥수수] NK603 (143bp) TC1507 (103bp)	NK603 01-5' NK603 01-3' TC1507 01-5' TC1507 01-3'	5'-TAT CTT GCT CGA TGC CTT CTC C-3' 5'-ACA CCA TTG CAG ATT CTG CTA ACT-3' 5'-GCT TCA ACA GGG CTG AGT TTG-3' 5'-CCC CAC ACA GTT TGG GAT CTA-3'

현 행	개 정(안)
(2) PCR용 시약의 조제 ① 표준 DNA 용액의 조제 ----- 다만, 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 대신 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하고 있는 양성 확인용 플라스미드를 사용할 수 있다. ② PCR 반응 시약의 조제 ----- 표 1의 AOAC학회지에 보고된 방법의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표3과 같다. (3) (생 략) (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ① 영동조의 준비 ----- 필요량의 아가로스를 칭량하여, TAE(Tris -acetate/EDTA)완충액(0.5배)을 넣고 가열하여 아가로스를 녹인다. 또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 전(前)염색법의 경우에는 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃정도로 식혀서 100㎖당 1㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10㎎/㎖)을 넣고 잘 혼합한다. 겔이 55℃정도로 식으면 겔 조제용 틀에 겔을 넣고 홈을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 TAE 완충액(0.5배)을 부어 홈을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 TAE 완충액(0.5배)을 채운다.	(2) PCR용 시약의 조제 ① 반응대조군으로 사용되는 표준 DNA 용액의 조제 ----- 한편, 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR하는 경우 2% 표준시료에서 추출한 DNA 대신 Nippon Gene사(일본)에서 제작하여 시판하고 있는 양성 확인용 플라스미드도 사용할 수 있다. ② PCR 반응 시약의 조제 ----- 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 PCR 반응액의 일반적 조성은 표3과 같다. (3) (현행과 같음) (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ① 영동조의 준비 ----- 필요량의 아가로스를 칭량하여, 전기영동 완충액을 넣고 가열하여 아가로스를 녹여 사용한다. 전기영동 완충액으로는 1배의 TAE(Tris-acetate/EDTA) 완충액 또는 TBE(Tris-borate/EDTA) 완충액을 사용할 수 있으나, 아가로스 겔의 제조 시 사용된 완충액과 같은 것을 전기영동과정 및 겔의 염색과정에서도 사용하여야 한다. 또한 200bp이하의 작은 크기의 PCR 증폭산물을 전기영동하므로 아가로스는 겔 강도가 높은 것을 사용한다. 아가로스가 충분히 녹아 겔이 균일하게 되면 55℃정도로 식혀서 겔 조제용 틀에 넣고 홈을 끼운 후 30분가량 방치하여 충분히 겔을 굳힌다. 전(前)염색법의 경우 겔 조제용 틀에 넣기 전에 아가로스겔 100㎖당 5㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr) 용액(10㎎/㎖)을 넣고 잘 혼합하며, 후(後)염색법의 경우 겔 조제 시 에티디움 브로마이드를 넣지 않는다. 겔이 굳으면 겔이 잠기도록 전기영동 완충액을 부어 홈을 조심스럽게 뺀다. 겔을 전기영동조에 장착하고, 겔의 윗면이 충분히 잠길 정도로 전기영동 완충액을 채운다.

현 행	개 정(안)
② 전기영동 ---- 시료를 주입 후, 50～100V의 전압에서 전기영동한다. ---- ③ 겔의 염색 후(後)염색법의 경우 TAE 완충액(0.5배) 100㎖당 5㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10㎎/㎖)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 증류수에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다. ④ 결과의 확인(생 략) (5) 분석 결과의 판정 및 처리 ①～② (생략) ③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21이 있다. ④ (생략) 6) 정량분석방법 (생략)	② 전기영동 ---- 시료를 주입 후, 100V의 전압에서 전기영동한다. ---- ③ 겔의 염색 후(後)염색법의 경우 전기영동 완충액 100㎖당 5㎕의 에티디움 브로마이드(EtBr)용액(10㎎/㎖)을 넣은 염색액에 영동이 끝난 겔을 즉시 넣은 후, 용기를 진탕기(shaker)에 올려놓고 가볍게 진동시키면서 20-30분 정도 염색한 후 다시 30분 정도 전기영동 완충액에 넣어 탈색시킨다. 전염색법의 경우 이 조작은 불필요하며 바로 결과를 확인할 수 있다. ④ 결과의 확인(현행과 같음) (5) 분석 결과의 판정 및 처리 ①～② (현행과 같음) ③ 유전자재조합 작물 중 전사개시유전자(프로모터)로 35S를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, Bt176, T25, Mon810, NK603, TC1507이 있으며, 전사종결유전자(터미네이터)로 NOS를 사용하는 것으로는 RRS, Bt11, GA21, NK603이 있다. ④ (현행과 같음) 6) 정량분석방법 (현행과 같음)

현 행	개 정(안)
7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법 (1) Lateral flow strip법 (생략) (2) PCR법 ① (생략) ② CBH351 검출용 프라이머 ㉮ 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 프라이머를 사용한다. ㉯～㉰ (생략) (3) 결과의 판정 내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 프라이머를 사용한 것에서 151bp의 PCR 증폭산물이 검출되고 ------ 8) (생 략) <신 설>	7) 스타링크 옥수수(CHB351)의 분석법 (1) Lateral flow strip법 (현행과 같음) (2) PCR법 ① (현행과 같음) ② CBH351 검출용 프라이머 ㉮ 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다. ㉯～㉰ (현행과 같음) (3) 결과의 판정 내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고------ 8) (현행과 같음) 9) Bt10 옥수수의 분석법 옥수수 원곡 또는 옥수수 가공식품에 대하여 해충저항성 및 제초제 내성 유전자재조합 옥수수 Bt10을 검출하기 위한 방법이다. (1) DNA의 추출 및 PCR 3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액을 사용하며, 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용한다. ① 내재성 유전자를 확인하기 위하여 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한다. ② Bt10 옥수수 검출용 프라이머는 다음과 같다. F-primer(JSF5) : 5'-CAC ACA GGA GAT TAT TAT AGG GTT ACT CA-3' R-primer(JSR5) : 5'-ACA CGG AAA TGT TGA ATA CTC ATA CTC T-3'

현 행	개 정(안)
	(2) PCR 증폭산물의 확인 Bt10 옥수수 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 위양성결과를 방지하기 위하여 다음과 같이 제한효소 확인시험을 실시한다. ① 제한효소 확인시험 117bp로 추정되는 시료의 PCR 증폭산물 10㎕에 SspI(Invitrogen사 제품) 1㎕ (10 units)와 REACT6 buffer 1㎕를 가하여 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응액 10㎕와 1/6배의 염색액(gel loading buffer) 2㎕를 혼합하고, 그 혼합액 10㎕를 3% 아가로스겔에서 염색액에 함유된 BPB가 겔의 약 90% 가량 전개될 때까지 전기영동한다. Bt10 옥수수 추출 DNA를 함유한 양성대조군의 PCR 증폭산물에 대해서도 동일한 조건으로 제한효소를 처리하고 전기영동을 실시한다. 이때 단편의 크기 비교가 용이하도록 양성대조군과 시료를 1조로 하여 아가로스겔에 로딩하며, 표식 DNA (Marker DNA)로는 25/100bp DNA ladder를 사용한다. 5) 정성분석방법 (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ③ 겔의 염색 및 ④ 결과의 확인에 따라 77bp와 40bp의 밴드가 나타나는지를 확인한다. (3) 결과의 판정 내재성 유전자를 확인하기 위해 SSIIb-1 또는 SSIIb-3 프라이머를 사용한 것에서 특이적인 PCR 증폭산물이 검출되고, Bt10 검출용 프라이머를 사용한 것에서 117bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, 117bp의 PCR 증폭산물에 대한 제한효소 분해산물이 2개의 DNA 단편으로서 그 크기가 77bp와 40bp임이 확인되는 경우 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “Bt10 옥수수 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “Bt10 옥수수 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액

현 행	개 정(안)
<신 설>	에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다. 10) 해충 저항성 Bt 쌀의 분석법 쌀 또는 쌀 가공식품에 대하여 해충 저항성 Bt 쌀을 검출하기 위한 방법이다. 쌀 내재성 유전자와 NOS 터미네이터에 대한 프라이머를 사용하여 1차 스크리닝 PCR을 하며, 그 결과가 양성인 경우 확인 PCR 및 제한효소 확인시험에 의해 혼입 여부를 판정한다. (1) DNA의 추출 및 PCR 최소한 6,000립 또는 200g 이상을 취하여 분쇄기로 균질하게 분쇄한 것을 분석시료로 사용하며, 3) DNA의 추출정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA용액에 대하여 5) 정성분석방법의 정성 PCR방법에 따라 PCR을 실시하되 다음의 프라이머를 사용하여 표 11에 따라 PCR을 실시한다. ① 내재성 유전자를 확인하기 위한 프라이머는 다음과 같으며, PCR 반응액 25㎕에 프라이머(10μM)를 각각 0.3㎕씩 가하여 사용한다. F-primer(OsSPS-F) : 5'-GAT CGG TTC CGC CAT TAG CA-3' R-primer(OsSPS-R) : 5'-AAC CGA GCG CGA TCA CTT GC-3'

현  행

개 정(안)

표 11. 해충 저항성 Bt 쌀 검사용 PCR 조건

	온도	시간	cycle 수
최초의 변성	95℃	5분	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension)	95℃ 62℃ 72℃	30초 30초 30초	40 cycles
최종신장(elongation)	72℃	8분	1 cycle
보존	4℃	-

(2) PCR 증폭산물의 확인

해충 저항성 Bt 쌀 검출용 프라이머를 사용한 것에서 147bp의 PCR 증폭산물이 검출된 경우, 위양성결과를 방지하기 위하여 다음과 같이 제한효소 확인시험을 실시한다.

① PCR 증폭산물의 정제

QIAquick PCR purification kit(Qiagen사)를 사용하여 PCR 산물을 정제한다. 147bp로 추정되는 PCR 증폭산물 20㎕에 100㎕의 PB buffer를 넣고 혼합한 후, 혼합액을 QIAquick spin column에 넣고, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한다. Column에 750㎕의 PE buffer를 넣고, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 여액을 버린다. 다시 튜브를 column에 장착하고, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 여액을 버린다. 새로운 튜브를 column에 장착하고 25㎕의 EB buffer 또는 멸균수를 이용하여 정제된 PCR 증폭산물을 회수한다.

현 행	개 정(안)
	② 제한효소 확인시험 정제된 PCR 증폭산물 23㎕에 XhoI 1㎕(20 units)와 Buffer 2(10x) 3㎕, BSA(10x) 3㎕를 가하여 잘 섞은 후 37℃에서 3-4시간 반응시킨다. Buffer 2(10X)와 BSA(100X)는 Xho I 제품(NEB, New England BioLabs Inc.)에 포함되어 있으며, BSA(100X)는 사용 전 10X로 희석하여 사용한다. 다만, 상기의 반응액 조성은 PCR 산물의 정제 효율에 따라 달라질 수 있으므로 제한효소의 양은 상황에 따라 적절히 사용할 수 있다. 상기 반응액 10㎕와 1/6배의 염색액(gel loading buffer) 2㎕를 혼합하고, 그 혼합액 10㎕를 3% 아가로스겔에서 염색액에 함유된 BPB가 겔의 약 90% 가량 전개될 때까지 전기영동한다. 이때 단편의 크기 비교가 용이하도록 표식 DNA (Marker DNA)로 25/100bp DNA ladder 또는 φX174DNA/Hae III를 사용한다. 5) 정성분석방법 (4) 전기영동에 따른 결과의 판정 ③ 겔의 염색 및 ④ 결과의 확인에 따라 98bp와 49bp의 밴드가 나타나는지를 확인한다. (3) 결과의 판정 내재성 유전자를 확인하기 위해 OsSPS 프라이머를 사용한 것에서 110bp의 PCR 증폭산물이 검출되고, NOS 터미네이터 검출용 프라이머를 사용한 것에서 151bp의 PCR 증폭산물이 확인되며, Oscry1Ac/OsNOS 프라이머를 사용한 것에서 147bp의 PCR 증폭산물이 확인되고 이에 대한 제한효소 분해산물이 2개의 DNA 단편으로서 그 크기가 98bp와 49bp임이 확인되는 경우 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정한다. 두개의 DNA 추출액 중 하나라도 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 판정된 경우 해당 시료는 “해충저항성 Bt 쌀 검출”이라고 최종 판정한다. 또한 두개의 DNA 추출액 중 하나의 추출액에서 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경

현 행	개 정(안)
	우에는 다시 전기영동을 실시하여 PCR 증폭산물을 확인하고, 역시 내재유전자에 해당하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않은 경우에는 그 추출액에서의 결과를 무시하고 다른 DNA 추출액의 결과만으로 판정한다. 두 개의 DNA추출액에서 모두 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물을 검출할 수 없는 경우에는 다시 DNA 추출을 1회 실시하여 PCR 후 판정한다. 재차 추출한 DNA 추출액에서도 내재유전자에 대응하는 PCR 증폭산물이 검출되지 않을 때는 “검사불능”으로 판정한다.